单细胞RNA测序（scRNA-seq）作为一种高通量测序技术，它允许研究者在单个细胞水平上测量基因表达，揭示细胞群体内部的异质性，识别不同细胞类型或状态的基因表达模式，为细胞生物学、发育生物学、疾病研究和药物发现等领域的研究提供了新的维度和深度。

单细胞RNA测序技术起始于单细胞分离，Bio-Techne单细胞柔性系统Pala为单细胞分选提供了快速便捷的途径。以下实验通过单细胞柔性分选系统Pala分选经细胞活性染料及特异性荧光抗体标记的单个活化B细胞。通过对静息及活化B细胞基因表达分析研究活化对基因表达的影响。

实验步骤

（1）利用mCD40L-3T3饲养细胞对人原代记忆B细胞活化6天。收集活化后细胞并用抗人CD27-PE抗体及细胞活性染料CellTrackerGreen进行染色。

（2）在板中加入每孔4微升裂解液，利用单细胞柔性分选系统Pala将PE及FITC阳性细胞分选至96孔PCR板中。细胞裂解后进行cDNA合成及RNA建库测序。

（3）每孔中进行VH及VL抗体可变区基因特异性扩增（qPCR）。

（4）基因文库利用Illumina Nextseq进行测序，比较活化及静息状态下B细胞的基因表达差异。

实验结果

（1）单细胞分离效率：经过扩增后，96孔中有93孔含有cDNA（97%）。

（2）单细胞验证：Sanger测序表明所有的孔中都是单个细胞，不存在二聚体的情况。

（3）免疫球蛋白基因表达：免疫球蛋白qPCR结果显示所有所有样品中均表达重链IGVH，轻链仅表达kappa或lambda（IGVK、IGVL）中的一种。